Stochastické zobrazení – STORM

Stochastické zobrazovací metody využívají osvětlení vzorku v širokém zorném poli a rychlou nízkošumovou kameru. Metoda vyžaduje speciální barvivo (fluorofor), které je možné „přepnout“ mezi stavem aktivního vyzařování a tzv. tmavým stavem. V aktivním stavu vybudí laserové osvícení ve fluoroforu fluorescenční emisi, zatímco v tmavém stavu k žádné emisi nedochází.

Během experimentu je pro každý snímek kamery aktivováno pouze několik molekul fluoroforu, takže jednotlivé obrazy z kamery obsahují pouze několik nepřekrývajících se světelných bodů fluorescenční emise. Mezi snímky jsou náhodně vybrány jiné molekuly fluoroforu, které jsou přepnuty do aktivního stavu, zatímco molekuly vybuzené v předchozím snímku jsou uvedeny do tmavého stavu. Celý proces je až několiktisíckrát opakován. Série snímků je pak složena speciálním softwarem do výsledného obrazu.

Tímto postupem lze dosáhnout rozlišení cca 20 nm až 50 nm v xy rovině a díky nejnovějšímu astigmatickému zobrazování je možné získat z-ovou osu s rozlišením až 50 nm. Dále je možné zkombinovat i více fluoroforů s různou barvou emise a studovat interakci mezi různými biologickými molekulami.

Pro STORM měření je vhodný 3W OPSL laser Coherent Genesis s vlnovou délkou 561 nm, která odpovídá používaným barvivům EosFP a Cy3. Výhodou tohoto laseru je schopnost dostatečně osvětlit zorné pole až 200 x 200 µm a přímá modulace v rozsahu 600 Hz až 1kHz, která minimalizuje celkovou akviziční dobu jednoho snímku.